一、蛋白樣品的制備與定量

蛋白樣品制備是 Western Blotting 的第一步，也是決定 WB 成敗的關(guān)鍵步驟之一。蛋白提取總體原則與注意事項包括：1) 盡可能提取完全或降低樣本復雜度使得集中于提取目的蛋白；2) 保證蛋白處于可以溶解狀態(tài)（選擇合適的裂解液的pH 、鹽濃度、 表面活性劑、還原劑等）；3) 提取過(guò)程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等（冰盒中低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）；4) 盡量去除核酸，多糖，脂類(lèi)等干擾分子。蛋白定量的方法有很多種，應用較多的主要有兩種：BCA蛋白定量檢測法和Bradford蛋白定量檢測法，用RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，由于含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測定由RIPA裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。

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百瑞極RIPA組織/細胞裂解液（BN25011）是一種傳統的細胞組織快速裂解液，得到的蛋白樣品可用于常規的Western、IP等實(shí)驗。RIPA裂解液種類(lèi)很多，根據其裂解液的強度不同分為強、中、弱三類(lèi)，請根據檢測樣本與檢測目的的不同選擇適當的裂解液。 

百瑞極蛋白酶抑制劑Cocktail（BN25002)由6種獨立的蛋白酶抑制劑（不含 EDTA）按照優(yōu)化的配比配置而成的蛋白酶抑制劑混合物,作用的靶點(diǎn)分別為絲氨酸蛋白酶，絲氨酸半胱氨酸蛋白酶，氨肽酶，半胱氨酸蛋白酶 和天冬氨酸蛋白酶等，是廣譜蛋白酶抑制劑。

百瑞極BCA蛋白濃度測定試劑盒（BN27109)是一種靈敏并且抗干擾能力強的蛋白定量檢測試劑盒，對去垢劑耐受能力強，特別適合用于 RIPA 裂解液提取的細胞和組織蛋白樣品中的蛋白濃度測定。 

二、SDS-PAGE電泳

樣品制備完成后，需要通過(guò)電泳將不同分子量大小蛋白有效分開(kāi)，以便能夠檢測目的蛋白的表達水平，廣泛采用的是SDS-PAGE，在電泳體系中加入變性劑SDS和還原劑DTT或者巰基乙醇等，蛋白質(zhì)分子的多聚體或者高級結構會(huì )被打開(kāi)，蛋白質(zhì)氨基酸側鏈和SDS結合形成蛋白-SDS復合物，所帶的負電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)原有的電荷量，因此可以有效消除不同蛋白質(zhì)分子間的電荷差異和空間結構差異。所以SDS-PAGE檢測時(shí)，可以利用分子篩效應將蛋白質(zhì)依據分子量大小分離開(kāi)來(lái)。

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百瑞極彩虹245廣譜蛋白Marker(11-245KD,BN27002)包含12種彩色預染的已知分子量標準蛋白，可用于直接觀(guān)察蛋白質(zhì)電泳狀況以及清晰地判斷Western Blot的轉膜效果。

百瑞極SDS-PAGE電泳緩沖液（BN20116）為10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，常用于蛋白變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗，10×濃縮液，便于儲存、操作簡(jiǎn)便。 

三、轉膜

轉膜是將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉移到固相載體上，同時(shí)維持其相對位置和分辨率的過(guò)程,主要分兩種：濕轉和半干轉。半干轉耗時(shí)短，但是更適合小分子蛋白的轉印，而濕轉蛋白分子量范圍較寬，兩者的比較見(jiàn)表在 Western Blot 實(shí)驗中，常用的是濕轉。

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百瑞極10×電泳轉移緩沖液（BN20181）是用于中濕法以及半干法電泳轉膜的緩沖試劑，為10×濃縮液，不含 SDS 和甲醇，便于儲存、操作簡(jiǎn)便。

百瑞極WB 封閉液(BN21013)用于轉移后蛋白的NC膜或PVDF膜非特異性結合位點(diǎn)的封閉，可以減少后續的一抗或二抗與膜的非特異性結合，降低背景著(zhù)色，增強信噪比。

百瑞極膜再生液（BN21014）可以對同一張膜進(jìn)行多次WB檢測，特點(diǎn)是無(wú)毒、無(wú)味、無(wú)害，室溫下使用，室溫下保存，可對同一張膜進(jìn)行 5 次以上的WB檢測。

四、免疫反應與檢測

轉膜后凝膠中的蛋白被固定在膜上，需要有效檢測目標蛋白，定性及定量樣品中蛋白質(zhì)與對應豐度。蛋白印跡檢測使用針對目標蛋白具有特異性的一抗，再雜交酶或熒光分子標記的二抗，然后進(jìn)行檢測。正確選擇、使用合適的一抗和二抗對于最大化信號，同時(shí)降低背景至關(guān)重要。蛋白上樣內參的正確使用對于蛋白印跡的信號歸一化也至關(guān)重要。

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百瑞極Western一抗/二抗稀釋液（BN21010/21012）是新一代的高效抗體稀釋液，總體效果顯著(zhù)優(yōu)于傳統的基于BSA(牛血清白蛋 白)、脫脂奶粉等的抗體稀釋液，有效節約抗體，稀釋液不含血清和白蛋白，確保極高的信噪比。

百瑞極羊抗兔IgG-HRP標記（BN20601）、羊抗小鼠IgG-HRP標記（BN20602），為常用HRP標記二抗。

百瑞極超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（BN16009）為免疫印跡實(shí)驗提供明亮的信號和低皮克級檢測靈敏度，ECL底物能夠兼容各種膜、封閉液和寬范圍抗體稀釋液，以出色性能、通用性和高性?xún)r(jià)比，滿(mǎn)足用戶(hù)的免疫印跡應用需求。