細胞凋亡（apoptosis）也稱(chēng)為程序性細胞死亡（programmed cell death），在多個(gè)信號通路的參與下，是一個(gè)高度受控的過(guò)程。細胞凋亡不僅可以去除機體不再需要的、多余的細胞和組織，使機體正常生長(cháng)和發(fā)育，而且還能殺死過(guò)剩的免疫細胞和受到病毒感染或出現DNA損傷的細胞，最大限度地減少這些細胞對機體的威脅。

區別于損傷導致的細胞壞死，凋亡細胞的形態(tài)學(xué)特征為核染色質(zhì)凝聚、細胞皺縮，以及膜結合的凋亡小體的產(chǎn)生，還會(huì )出現DNA片段化和多種胞內蛋白的分解或降解。

檢測細胞凋亡的方法有很多，有根據凋亡細胞固有的形態(tài)特征，利用光學(xué)顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡等來(lái)觀(guān)察細胞形態(tài)；也有根據細胞凋亡過(guò)程中的時(shí)相變化檢測是否發(fā)生凋亡，常見(jiàn)的有Caspase活性檢測、Annexin V檢測、線(xiàn)粒體膜電位檢測、TUNEL檢測等。細胞發(fā)生凋亡時(shí)，不同區域內（如細胞膜、細胞漿、線(xiàn)粒體、細胞核等）會(huì )發(fā)生不同的生理生化改變。因此，針對不同區域的細胞凋亡檢測要采用不同的方法。

細胞凋亡有個(gè)典型特征是線(xiàn)粒體活性受損，包括膜電位和線(xiàn)粒體氧化還原能力的改變。發(fā)生這些的主要原因是線(xiàn)粒體膜通透性轉換孔的打開(kāi)，引起離子和小分子的進(jìn)出和細胞色素c的釋放。

JC-1是一種廣泛用于檢測線(xiàn)粒體膜電位的理想熒光探針?？梢詸z測細胞、組織或純化的線(xiàn)粒體膜電位，線(xiàn)粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個(gè)標志性事件。正常生理狀態(tài)下，線(xiàn)粒體負電性高，JC-1進(jìn)入線(xiàn)粒體以多聚體存在，紅色熒光強，細胞凋亡時(shí)，線(xiàn)粒體去極化產(chǎn)生，負電性降低，JC-1則以單體存在細胞質(zhì)，綠色熒光增強。

這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉變來(lái)檢測線(xiàn)粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區分細胞凋亡或其他原因導致的線(xiàn)粒體膜電位的變化。

線(xiàn)粒體膜電位探針JC-1 染料

JC-1 染料法檢測線(xiàn)粒體膜電位變化

細胞膜在整個(gè)細胞凋亡過(guò)程中都會(huì )持續發(fā)生變化。細胞膜變形或起泡發(fā)生在細胞凋亡早期，隨著(zhù)細胞凋亡的進(jìn)展，細胞膜脂質(zhì)成分和完整性也會(huì )發(fā)生變化。例如，磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞質(zhì)膜的內部小葉外翻到外部小葉上，進(jìn)而暴露在細胞外部環(huán)境中。

凋亡細胞質(zhì)膜上PS的外翻

Annexin Ⅴ是一種分子量為35-36kD的Ca依賴(lài)性磷脂結合蛋白，正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內側，細胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V作為一種磷脂結合蛋白，可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS, 而活細胞的PS位于細胞膜的內表面，無(wú)法與Annexin V特異性結合。所以可以用FITC偶聯(lián)的annexin V鑒別凋亡細胞和活細胞。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒標記后可以使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過(guò)細胞膜而使細胞核紅染。壞死細胞的PS也會(huì )從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面，Annexin V也能識別壞死細胞表面的PS, 所以Annexin V無(wú)法區分壞死細胞和凋亡細胞。而PI染料能夠與細胞內的DNA結合，區分壞死細胞和活細胞。早期凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整， PI染料無(wú)法自由通過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞內與DNA結合，所以PI染料無(wú)法標記凋亡細胞和活細胞，而PI染料卻能夠通過(guò)壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合，壞死細胞內PI染料被488nm激光激發(fā)后會(huì )發(fā)射紅熒光，被相應通道接收。所以Annexin V和PI同時(shí)使用，就可以區分活細胞、早期凋亡細胞和壞死細胞。

Q1：左上象限（UL）為（Annexin V-/PI+），可能是已經(jīng)沒(méi)有細胞膜的細胞碎片，或者其他原因導致的死亡細胞；

Q2：左下象限（LL）為正常（活）細胞（Annexin V-/PI-）；

Q3：右上象限（UR）為晚期凋亡細胞（Annexin V+/PI+）；

Q4：右下象限（LR）為早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）。

半胱天冬酶（Caspase）活化是細胞凋亡早期的重要信號。半胱天冬酶屬于半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶家族，是細胞凋亡相關(guān)的復雜細胞過(guò)程的關(guān)鍵調節因子。絕大多數情況下，所有的凋亡信號都會(huì )匯集到凋亡的最終執行者 Caspase-3 上。在正常細胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被激活，并執行最后的凋亡程序。因此可以通過(guò)檢測 Caspase 3 剪切體的含量或 Caspase 3 的活性來(lái)反應細胞凋亡過(guò)程。此外，也可以通過(guò)檢測 Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量來(lái)檢測細胞凋亡。

半胱天冬酶活性檢測試劑盒SuperViewTM 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells

細胞凋亡過(guò)程中細胞核形態(tài)變化的特征是DNA鏈斷裂、DNA片段化、核膜降解和細胞核起泡、產(chǎn)生微核。

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下，將脫氧尿苷三磷酸核苷酸(dUTP)和熒光素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細胞的檢測，稱(chēng)為T(mén)UNEL法。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL是檢測DNA片段化（細胞凋亡）的最常用方法。

TUNEL 法檢測苦參堿刺激下 HepG2 細胞凋亡情況

TUNEL的全稱(chēng)是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記。是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

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