線(xiàn)粒體是動(dòng)植物細胞生成ATP的主要地點(diǎn)，是促進(jìn)細胞能量轉換、參與細胞凋亡的重要細胞器。線(xiàn)粒體在呼吸氧化過(guò)程中，將所產(chǎn)生的能量以電化學(xué)勢能儲存于線(xiàn)粒體內膜，在內膜兩側造成質(zhì)子及其他離子濃度的不對稱(chēng)分布而形成線(xiàn)粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，MMP，ΔΨm)。正常的MMP是維持線(xiàn)粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件，MMP的穩定有利于維持細胞的正常生理功能。

線(xiàn)粒體亞顯微結構

線(xiàn)粒體是細胞能量和新陳代謝的重要調節者，對維持細胞的生長(cháng)和存活起著(zhù)至關(guān)重要的作用。線(xiàn)粒體的核心功能是通過(guò)氧化磷酸化合成ATP，這就是眾所周知的線(xiàn)粒體生物能量學(xué)。而ATP的產(chǎn)生，是與線(xiàn)粒體膜電位有關(guān)的。線(xiàn)粒體通過(guò)由電子傳遞鏈產(chǎn)生的膜電位梯度來(lái)維持氧化磷酸化，從而驅動(dòng)ATP的合成。這一步是通過(guò)位于線(xiàn)粒體內膜的質(zhì)子泵完成的，質(zhì)子泵可以將基質(zhì)內質(zhì)子（H+）泵入膜間隙，質(zhì)子的跨膜轉運使線(xiàn)粒體膜間隙積累大量質(zhì)子，形成跨線(xiàn)粒體內膜的跨膜電位，即線(xiàn)粒體膜電位。當質(zhì)子返回時(shí)便推動(dòng)生命體最重要的能量貨幣ATP的產(chǎn)生，人體的ATP有95%為線(xiàn)粒體所提供。

正常情況下，線(xiàn)粒體內膜電位較高，保持在負電位，而外膜電位較低，保持在正電位。當某些因素導致線(xiàn)粒體呼吸鏈電子傳遞過(guò)程障礙，影響基質(zhì)內質(zhì)子（H+）跨膜梯度的形成，就會(huì )導致外正、內負的線(xiàn)粒體膜電位下降，即去極化。大量研究表明，線(xiàn)粒體膜電位下降與自噬、凋亡或壞死等有關(guān)。線(xiàn)粒體膜電位功能障礙，甚至細微的異常變化，都可能極大地影響細胞內的生物活性，引起各種疾?。ò柎暮Ｄ?、糖尿病和癌癥等）。

線(xiàn)粒體膜電位示意圖

因此，線(xiàn)粒體膜電位是評價(jià)線(xiàn)粒體正常功能的重要指標之一，不僅反映了線(xiàn)粒體功能的完整性，對ATP的合成、離子的轉運、細胞凋亡的調控以及抗氧化作用都具有重要的影響，同時(shí)也反映了細胞的健康狀況，對細胞的生存和發(fā)展具有重要的意義。另外，檢測線(xiàn)粒體膜電位的變化對生物學(xué)研究和醫學(xué)診斷也具有重要意義。所以，我們應該重視線(xiàn)粒體膜電位的變化，并采取相應的措施來(lái)保護線(xiàn)粒體的正常功能。

JC-1 是一種廣泛用于檢測線(xiàn)粒體膜電位的理想熒光探針，可以用來(lái)檢測細胞、組織或純化的線(xiàn)粒體膜電位。在線(xiàn)粒體膜電位較低時(shí)，JC - 1 不能聚集在線(xiàn)粒體的基質(zhì)中，此時(shí) JC - 1 為單體，最大發(fā)射波長(cháng)為 527 nm，可以產(chǎn)生綠色熒光；在線(xiàn)粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 聚集在線(xiàn)粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，最大發(fā)射波長(cháng)為590 nm，可以產(chǎn)生紅色熒光。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉變來(lái)檢測線(xiàn)粒體膜電位的變化。

JC-1進(jìn)入線(xiàn)粒體和聚集物生成的示意圖

Rhodamine 123 是一種可透過(guò)細胞膜的陽(yáng)離子綠色熒光染料，可作為線(xiàn)粒體膜電位的指示劑，其在正常細胞中能夠依賴(lài)線(xiàn)粒體膜電位進(jìn)入線(xiàn)粒體基質(zhì)，熒光強度弱。而在凋亡發(fā)生時(shí)，線(xiàn)粒體膜完整性破壞，線(xiàn)粒體膜通透性轉運孔開(kāi)放，引起線(xiàn)粒體膜電位的降低，Rhodamine 123 重新釋放出線(xiàn)粒體，從而發(fā)出強黃綠色熒光，廣泛用作檢測線(xiàn)粒體膜電位的熒光探針，并且對細胞沒(méi)有任何毒性。

TMRM（四甲基羅丹明甲酯）/TMRE （四甲基羅丹明乙酯）是一種陽(yáng)離子細胞滲透型熒光染料，易與活躍的線(xiàn)粒體螯合，是可用能斯特方程定量測量膜電位的優(yōu)選染料。染料不會(huì )在細胞膜中形成聚集體，并且與膜蛋白具有最小的相互作用。因此，根據能斯特方程，染料的跨膜分布與膜電位直接相關(guān)。

它們除了可以選擇性的對線(xiàn)粒體進(jìn)行染色外，與JC-1一樣，TMRM和TMRE也廣泛地用于線(xiàn)粒體膜電位的測定。這兩種特殊的羅丹明酯將線(xiàn)粒體染色，帶有橙色熒光。它們的光譜特征與TRITC相似，這是TMRM和TMRE使用起來(lái)非常方便。TMRE的疏水性比TMRM略微強一點(diǎn)。

MitoScene TM Red CMXRos 是一種紅色熒光染料，含有氯甲基官能團，可標記線(xiàn)粒體。只需與活細胞簡(jiǎn)單孵育即可被動(dòng)運輸穿過(guò)細胞膜并直接聚集在活性線(xiàn)粒體上，該染料的積累取決于膜電位的高低。一旦線(xiàn)粒體被染色后，還可根據后續實(shí)驗的需求用醛類(lèi)固定劑進(jìn)行固定。對于免疫組化及原位雜交實(shí)驗，細胞需先經(jīng)過(guò)透化，MitoScene TM Red CMXRos 還可染色透化細胞的線(xiàn)粒體。該染料適合雙標記實(shí)驗，其紅色熒光與其他的綠色熒光探針可以很好的區分開(kāi)來(lái)?？梢匀舅兰毎?。

4-Di-1-ASP 是苯乙烯基染料，用于染色活細胞線(xiàn)粒體。它也被用于染色神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、活體大腦組織等。在顯微鏡成像時(shí)可發(fā)出綠色熒光 (λex /λem = 475/606 nm)。

DASPEI 是一種苯乙烯基染料，可以染色活細胞的線(xiàn)粒體。DASPEI 的激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)在 550/573 nm，熒光壽命強，靈敏度高。DASPEI 可以對活細胞中的線(xiàn)粒體進(jìn)行染色，具有良好的標記性，也可獨立于神經(jīng)元活性用于突觸前神經(jīng)末節的染色。

MitoSceneTM Green I是一種線(xiàn)粒體綠色熒光染料，可在納摩爾水平對線(xiàn)粒體進(jìn)行染色標記，該染料具有質(zhì)膜透性，且在線(xiàn)粒體膜上積累而呈現明亮的熒光。該染料在線(xiàn)粒體中的定位不依賴(lài)于線(xiàn)粒體膜電位，染色固定細胞信噪比不理想，在細胞固定、透化之后，會(huì )導致熒光信號減弱或丟失，所以我們推薦只用來(lái)染活細胞。

10-壬基吖啶橙（NAO）是吖啶橙的衍生物， 是一種用于完整細胞內線(xiàn)粒體特異性熒光標記物。與Rh123相比，細胞中NAO的積聚與質(zhì)子動(dòng)力驅動(dòng)關(guān)系不大，但是與線(xiàn)粒體相關(guān)膜蛋白或者脂類(lèi)發(fā)生作用相關(guān)。NAO的攝入不依賴(lài)于線(xiàn)粒體跨膜電勢差，可用于檢測線(xiàn)粒體。NAO可與心磷脂等帶負電荷磷脂特異性結合， 其與線(xiàn)粒體膜的相互作用不依賴(lài)于線(xiàn)粒體的膜電位；分析細胞凋亡時(shí)， 可用羅丹明123來(lái)檢測線(xiàn)粒體的膜電位， 而用NAO來(lái)檢測線(xiàn)粒體結構的完整性。NAO和羅丹明123（Rh123）是研究線(xiàn)粒體功能一對好的染料。