產(chǎn)品規格：50T，100T

產(chǎn)品內容：

儲存條件：4℃避光冷藏，請勿凍存。有效期見(jiàn)外包裝。

光譜特性 

     FITC-Annexin V: Abs/Em = 494/518 nm

     PI: Abs/Em = 535/617 nm (with DNA)

產(chǎn)品介紹 

     FITC-Annexin V 和 PI 凋亡試劑盒提供了一種快速簡(jiǎn)便的方法，通過(guò)標記早期凋亡細胞（綠色）和壞死細胞（紅色），用于檢測細胞凋亡水平。產(chǎn)品可以使用流式細胞儀或其它熒光檢測設備進(jìn)行檢測。

     FITC-Annexin V 可以標記凋亡細胞。Annexin V 選擇性結合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱(chēng) PS)。在細胞發(fā)生早期凋亡時(shí)，PS 會(huì )外翻到細胞表面，即細胞膜外側。用綠色熒光探針 FITC 標記的 Annexin V，即 FITC-Annexin V，可以結合外翻的磷酯酰絲氨酸，從而檢測細胞凋亡的重要特征。 

     碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結合染料，它可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞的細胞核。PI 可以由 488,532 或 546 nm 的激光激發(fā)，呈現紅色熒光。

使用方法 

     下列實(shí)驗方案以利用星形孢菌素誘導 Jurkat 細胞凋亡為例，如果使用其他誘導劑和其他類(lèi)型的細胞，實(shí)驗條件需要略作調整。

一、流式細胞檢測 

1. 根據實(shí)驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經(jīng)處理的細胞樣品，作為陰性對照。此外，設定一組樣品做單染， 用于調節補償。 

2. 收集細胞。懸浮細胞：300 g，4℃離心 5 min 收集細胞；貼壁細胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后 300 g，4℃離心 5 min收集細胞，胰酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，以防引起假陽(yáng)性。

     注：用胰蛋白酶消化然后使細胞在最佳細胞培養條件和培養 基中恢復約30分鐘，然后再染色。 胰蛋白酶消化會(huì )暫時(shí)破 壞質(zhì)膜，允許Annexin V結合磷脂酰絲氨酸在細胞膜的細胞 質(zhì)表面上，從而導致假陽(yáng)性染色。

3. 用預冷的PBS 洗滌細胞兩次，每次均在 300 g，4℃下離 心 5 min，收集 1-5×105 個(gè)細胞并用100 μL 1×結合緩沖液 重懸細胞。 

4. 每管加入 4-5 μL 的 FITC-Annexin V 和 5 μL 的 PI工作液。 

     注：我們推薦準備兩管額外的流式管，每管只加入一種單染染料（FITC-Annexin V 和PI），用于流式單染的補償調節。

5. 室溫避光孵育 10-15 min，為避免細胞凋亡進(jìn)程，孵育過(guò)程可在冰上操作。 

6. 每管加入 400 μL 的 PBS 或 1×結合緩沖液，盡快通過(guò)流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。FITC-Annexin V 可以由 488nm 激光激發(fā)，檢測熒光發(fā)射光譜約在 530 nm 處（FITC 通道），PI 通道發(fā)射光譜約在 617 nm 處（注：PBS 或 1×結合緩沖液的選擇根據不同凋亡處理以及不同細胞具體選擇）。

二、熒光顯微鏡檢測

     對于懸浮細胞，可參照流式細胞檢測的方法進(jìn)行具體操作。 

1. 在蓋玻片或載玻片小室中接種細胞。 

2. 根據實(shí)驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經(jīng)處 理的細胞樣品，作為陰性對照。 

3. 用PBS 洗滌細胞。 注：細胞收集后如果不用 PBS 清洗，可以用含血清的培養 基直接替代Annexin V 結合緩沖液，但是 Annexin V 的使用濃度需要重新優(yōu)化。 

4. 每 100 μL 的 Annexin V 結合緩沖液中加入 5-25 μL的FITC-Annexin V 和 5 μL 的PI。 

     注：最佳使用濃度由具體實(shí)驗要求確定。

5. 向培養板中加入足量的染液以覆蓋全部細胞，室溫避光 孵育 15-30 min。為避免細胞凋亡進(jìn)程，孵育過(guò)程可在冰上操作，但孵育時(shí)間至少延長(cháng)至 30 min。 

6. 用 1×結合緩沖液清洗細胞。 

7. 將孵育有細胞的蓋玻片置于載玻片上，載玻片可提前加一滴 1×結合緩沖液；對于培養在小室內的細胞，可直接加 入足量的 1×結合緩沖液覆蓋細胞。 

8. 使用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀(guān)察細胞 。FITC-Annexin V 可用 FITC 適用的濾光片，PI 可用 Cy3 或者 Texas。

注意事項： 

1. 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，保存和使用過(guò)程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。 

2. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。